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超濾離心管正確的使用
更新時間:2019-11-08   點擊次數(shù):1801次
   超濾離心管正確的使用
  1.選擇合適的超濾管。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書,注意超濾膜對各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同。
  2.新的超濾應(yīng)該是干燥的,使用前加入超純水,水量*過膜,冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕,加入蛋白液前,超濾管需要插在冰上預(yù)冷。
  3.直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機預(yù)冷至4度)。不同離心機的轉(zhuǎn)速rpm換算成g之后,有所不同。離心機的加速度調(diào)至低檔,減小對膜的壓力。
  注意,一定要等離心機達到目的轉(zhuǎn)速之后,方可離開離心機,否則離心機出問題時,無法時間處理。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機的情況是膜與軸垂直)。
  在實際使用中,一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,這樣可以延長離心管的使用壽命。
  4.當(dāng)濃縮到剩下1ml時,取50ul緩沖溶液,加入10ul流穿,看有沒變藍色,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要判斷是否漏管,用5mgml的BSA離心10min,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測,繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,防止蛋白受熱),直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀,要確定沉淀的具體原因,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾,降低濃度的辦法解決,后者的方法是換不同的緩沖溶液,直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
  5.前面幾步用以濃縮蛋白,如果要換Buffer,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候,輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾),再濃縮至1ml左右,連續(xù)三次,后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,一般不多于500ul,也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,三次達到1000倍以上,基本上可以達到換buffer的目的。
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